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      生物創新藥研發新動力——納米抗體最全制備技術分享

      2022-04-30
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            | 抗體


      抗體是由免疫B細胞受到抗原刺激產生的能夠特異性的和抗原結合的生物蛋白質分子。由于其能夠高特異性,高親和的結合抗原,抗體廣泛應用在學術研究、疾病診斷以及醫學藥物各個方面。


      | 傳統抗體分子


      傳統抗體分子(IgG)是一種結構相當保守的由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈組成的蛋白分子??贵w的輕鏈包含1個可變區和1個恒定區,即VLCL。而重鏈則擁有1個可變區和3個恒定區,即VH、CH1、CH2CH3。VH區和VL區共同組成傳統抗體識別抗原的最小單位,抗體可變區的序列差異決定了抗體能夠特異地識別不同的抗原。而CL區和CH區則相對保守,被稱為抗體的恒定區,其中CH區的CH2和CH3兩個區域對于抗體招募免疫細胞發揮ADCC和CDC功能有著重要的作用。


      | 重鏈抗體


      重鏈抗體為駝類和軟骨魚類中天然存在的僅由兩條重鏈組成的特殊抗體,包含一個重鏈可變區(VHH, Variable domain of heavy chain antibody)和兩個常規的CH2與CH3區,CH1區天然缺失。重鏈抗體通過重鏈上的一個可變區(VHH)結合抗原,該可變區可以單獨穩定地在體外存在,被稱為駝類單域抗體(SdAb)或者納米抗體(Nanobody)。納米抗體晶體直徑為2.5nm,長約4nm,分子量僅為傳統完整抗體的1/10(約15kD)但依然具有完整的抗原識別能力。



      重鏈抗體與納米抗體示意圖


      和傳統抗體相比,納米抗體分子量小,親水性佳,并且可以通過大腸桿菌進行體外重組表達進行大量生產,有效避免傳統抗體的批次間差異問題。得益于以上特征,使得納米抗體在新藥物發現方面具有一系列優勢,表現出極大的潛力:

      (1)可以結合傳統抗體結合不到的的位點,和靶點結合特異性更強;

      (2)組織穿透力更高;

      (3)更高的穩定性;

      (4)適合工業化大規模生產;

      (5)更容易改造和優化;

      (6)更容易人源化


      由于納米抗體的這些特征,越來越多的研究機構和藥物生產企業在不同的場景中關注、嘗試使用納米抗體。而納米抗體的開發不同于傳統單克隆抗體通過雜交瘤制備的方法,它一般通過免疫羊駝、構建噬菌體文庫和通過噬菌體展示來篩選出候選納米抗體,再通過納米抗體表達和純化后進行與抗原是否結合的驗證實驗。

      下面,我們將詳細講述篩選制備納米抗體的流程以及其中的關鍵點和操作技巧,其中的每一個步驟均由深圳康體生命經過多次優化和總結,供有需要和想嘗試納米抗體篩選的機構參考。



      01
      免疫羊駝篩選單域體


      獲得單域抗體的普遍方法是羊駝經過抗原免疫后通過體內免疫系統的作用使得抗體成熟,分離羊駝外周血B淋巴細胞,提取RNA,反轉錄獲取cDNA,以cDNA為底物PCR擴增獲取多樣化納米抗體基因片段,然后將多樣化納米抗體基因片段連接到噬菌粒上,構建噬菌體庫。然后通過噬菌體展示和篩選技術從羊駝抗體庫中篩選得到適合的候選納米抗體并對其進行驗證。整個流程主要包括羊駝免疫、噬菌體文庫構建、抗體篩選、表達純化及驗證等階段。

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      納米抗體的制備流程圖

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      https://www.sohu.com/a/325635387_682259



      02
      羊駝免疫的推薦流程


      1.抗原準備:一只未免適齡羊駝可以同時免疫1-3個抗原,每次免疫每種抗原劑量保持在0.5 mg左右,總體積在1.5 mL以下,免疫前將抗原和佐劑體積1:1乳化使其形成均勻混合物。


      2羊駝免疫:記錄空白羊駝耳號后開始免疫實驗。每次在羊駝頸部淋巴結附近分左右兩側皮下注射,每側分2點注射,每點注射約0.4mL乳化好的抗原。免疫后觀察半小時確認羊駝狀態良好,無不適癥狀。每2周免疫一次,至少進行4次免疫。


      3.血清分離:每次抗原免疫前進行采血用于免疫評價,每次取5 mL血液;血液當天使用預冷25℃離心機,4000 rpm離心10分鐘,分離凍存上層血清,用于后續抗體效價檢測。


      4.采血:在第4次免疫后間隔5-7天從羊駝頸部靜脈進行采血50 mL。


      5.分離淋巴細胞:在50 mL的離心管中先加入15 mL細胞分離液,然后緩慢加入15 mL血液。加入血液時小心緩慢以防止血液和分離液混勻。之后離心機預冷至25℃,400 xg離心30分鐘后,觀察離心管中血液分離情況,上層血清保存在新的離心管中,-80℃保存,用移液器小心吸取出中間棉狀上層免疫細胞至新的50 mL離心管中。每管加入室溫放置的10 mL PBS緩沖液,25℃,400 xg離心20分鐘。去除上清液,每管加入室溫放置的5 mL PBS緩沖液,輕輕混勻后,使用血球計數板計算細胞數目,然后25℃,400 xg離心20分鐘。去除上清液,根據細胞數目使用RNAiso Plus溶解分離得到的淋巴細胞得到107/mL細胞溶解液,-80℃保存。



      03
      免疫技巧


      1.羊駝的選擇和選擇合適的抗原是免疫成功的關鍵。選擇健康強壯、精神狀態良好、體型適中的未免羊駝即空白羊駝。免疫抗原的純度以及其正確構象對免疫羊駝后篩選到合適的抗體以及后續應用至關重要,蛋白抗原純度一般至少不低于90%。


      2.淋巴細胞的分離:及時的細胞分離可以有效阻止血液采集后的溶血以達到最好的分離效果。


      3.免疫周期的選擇可影響免疫效果,根據經驗,1-2周免疫間隔可以使羊駝對大部分抗原有良好的免疫反應。

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       羊駝免疫及采血圖

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      免疫效果檢測圖



      04
      構建噬菌體文庫推薦流程


      1.RNA提取:將用Trizol保存的外周血淋巴細胞冰上溶解后轉移至1.5 mL的離心管,加入1/5體積的氯仿震蕩混勻;室溫靜置5分鐘后4℃,12000g離心15分鐘;將離心后的上清液轉移到新的離心管;往新離心管中加入等體積的異丙醇;顛倒混勻室溫靜置10分鐘后4℃ 12000g離心10分鐘;棄上清后用75%乙醇清洗沉淀,4℃ 7500g 離心5分鐘后棄去上清,沉淀室溫晾干后溶解于適量的無RNA酶的水中。


      2.反轉錄獲取cDNA:按照反轉錄試劑盒說明書將上一步得到的RNA一分為二反轉錄成cDNA,反轉錄引物分別用Oligo dTrandom primers。


      3.抗體片段擴增:從反轉錄的cDNA中擴增特定的抗體片段,使用Taq DNA Polymerase Hot Start酶進行PCR擴增。PCR反應體系為:cDNA模板 2 μL,Alpa001F引物2 μL,Alpa001R引物 2 μL,10x Taq Buffer 5 μL,dNTP 4 μL, Taq(HS) 0.25 μL,ddH2O補足到50 μL。PCR的反應條件為:98℃ 3分鐘;95℃ 30秒,57℃30秒,72℃ 40秒,每個循環增加2秒,重復22個循環;72℃ 5分鐘。將得到的PCR擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳,可以看到一條1.0kb 左右一條0.7kb 左右的PCR條帶,對0.7 kb大小的條帶切膠使用DNA純化回收試劑盒按說明書進行回收。以上一步PCR擴增并回收后的DNA片段作為模板再次擴增特定的抗體片段,使用Taq DNA Polymerase Hot Start Version酶進行PCR擴增。PCR反應體系為:DNA模板 2 ul,Alpa002F引物 2 μL,Alpa002R引物 2 μL,10x Taq Buffer 5 μL, dNTP 4 μL, Taq(HS) 0.25 μL, ddH2O補足到50 μL。PCR的反應條件為:98℃ 3分鐘;95℃ 50秒,55℃30秒,72℃ 40秒,重復12個循環;72℃10分鐘。將得到的PCR擴增產物使用DNA純化回收試劑盒按說明書回收。 


      4.克隆至噬菌體質粒:將上一步擴增得到的多樣化抗體基因序列和噬菌體載體進行酶切,各自純化并進行鏈接反應。將連接產物使用DNA純化回收試劑盒按說明書回收,并使用超純水溶解。


      5.轉化TG1:提前將無菌的電轉杯置于冰上預冷,待TG1感受態細胞50 μL融化后加入100 ng回收后的連接產物,將混合后的感受態細胞和連接產物轉移到預冷好的電轉杯中,使用電轉儀預設的Bacteria轉化程序電擊轉化,電轉后立即往電轉杯中加入1 mL SOC培養基,至少進行20個電轉,將細胞37℃復蘇60分鐘后涂在含有氨芐抗性的LB培養板上過夜生長。將上一步過夜生長后的培養板上的細胞用2xYT培養基和涂布棒沖洗刮下,加入20%的甘油測OD600nm值后保存在-80℃,即為菌庫。


      6.擴增和純化噬菌體文庫:將上一步刮下的菌體混勻后將數目約為10^9個細菌轉移到100 mL預先加入氨芐抗生素的2x YT培養液中,37℃ 220 rpm培養直至OD600nm達到0.5。按照輔助噬菌體:細菌細胞數目為20:1的比例加入輔助噬菌體后繼續37℃培養30分鐘。加入終濃度為50 μg/mL的卡那霉素,30℃過夜搖床培養。將過夜培養的細菌4℃ 13000 rpm離心5分鐘,將上清轉移到新的離心管后加入1/4體積預冷的 5x PEG8000/NaCl,在冰上孵育30-60分鐘。4℃ 13000 rpm離心10分鐘去除上清后加入1 mL PBS緩沖液溶解沉淀。再次加入250 μL 5X PEG8000/NaCl 后冰上孵育10分鐘,4℃ 16000 xg離心15分鐘后去除上清并將沉淀溶解在1 mL PBS中得到噬菌體庫,長期-80℃保存,短期(1-2周)可于-20℃放置保存。



      05
      構建噬菌體庫推薦流程


      1.噬菌體文庫的庫容量和多樣性衡量文庫質量的重要標準之一,容量越大、多樣性越好的庫是成功篩選出納米抗體的有效保證;


      2.影響文庫容量和多樣性的關鍵點包括:提取RNA過程中RNA的降解、反轉錄過程中的模板和引物、擴增過程中引物的選擇和模板的用量以及PCR擴增輪數、感受態細菌的轉化效率、連接體系的大小等因素。


      第一輪PCR



      06
      抗原篩選鑒定推薦流程


      1.包被免疫管:將50 μg 抗原加入到2 mL PBS中并加入到免疫管中,4℃緩慢旋轉過夜孵育。


      2.封閉:將適量擴增和純化的噬菌體 加入到1 mL 3% BSA中,室溫旋轉孵育2小時。同時往包被好的免疫管中加入2-3 mL 3% BSA,室溫旋轉孵育2小時。


      3.抗原和噬菌體孵育:將封閉后的免疫管用含有0.01%吐溫的PBS洗3次,每次5分鐘。將封閉后的噬菌體文庫加入到封閉后的免疫管中,添加PBS直至2-3 mL,室溫旋轉孵育1小時。


      4.清洗:將抗原和噬菌體孵育后的免疫管用含有0.1%吐溫的PBS洗20次,每次5分鐘。


      5.洗脫:將免疫管內液體棄掉,盡量去除殘余液體,加入1 mL 0.25 mg/mL Trypsin溶液,室溫旋轉洗脫30分鐘,加入10 μL 10%AEBSF終止洗脫,將免疫管中的溶液轉移至新的1.5 mL離心管中,即為第一輪篩選噬菌體洗脫液。


      6.噬菌體洗脫液效價檢測:取第一輪噬菌體洗脫液10 μL,在1.5 mL離心管中10倍梯度稀釋,共稀釋10個梯度,在每個稀釋離心管中加入90 μL OD600為0.5-0.55的TG1菌液,混勻后37℃孵育30分鐘,將各個梯度的菌液涂布到2×YT固體培養基(Amp)中,37℃倒置過夜培養,第二天統計培養板上的單菌落個數并計算噬菌體洗脫液效價;


      7.第一輪噬菌體洗脫液的擴增:取500μl第一輪篩選后得到的噬菌體洗脫液至5 mL OD600為0.5-0.55的菌液中,37℃,250 rpm繼續培養30分鐘,將全部菌液均勻涂布到含有100 μg/mL Amp和2%葡萄糖的2%瓊脂糖的固體培養板中,37℃過夜培養。第二天將培養板的菌落刮下來收集至離心管中,即為擴增后的細菌子文庫。按照噬菌體文庫擴增和純化方法,再重復篩選過程2次,逐次減半包被免疫管的抗原量,得到3次篩選后的洗脫噬菌體。洗脫的噬菌體可進行NGS測序,得到與抗原結合的候選納米抗體DNA序列庫。


      8.ELISA鑒定


      8.1 將最后一輪篩選得到的噬菌體梯度稀釋后,各取10 μL加入到OD600nm為0.5的TG1菌液中,37℃培養30分鐘后涂布含有氨芐霉素的2x YT培養板上,37℃過夜培養第二天得到單克隆菌落;


      8.2 隨機挑選至少192個單菌落到含有氨芐霉素的2x YT培養液的96孔細胞培養板上,37℃過夜培養后作為種子菌板,重新取菌液2 μL 加入新的96孔板(每孔含200  μL 2x YT新鮮培養液,100 μg/mL 氨芐),37℃培養5小時后,往培養孔中加入輔助噬菌體每孔加入輔助噬菌體M13K07以使細菌個數:噬菌體數=1:20),37℃靜置30分鐘后加入終濃度為50 μg/mL的卡納霉素,30℃過夜培養。第二天將過夜培養后的菌液離心,獲得含噬菌體的上清液,4℃保存備用;


      8.3 將篩選抗原包被酶標板(1 ng/μL,包被液為pH9.4的CBS,100 μL /孔),同時平行包被BSA作對照,4°C包被過夜;將過夜包被的酶標板內液體棄掉,每孔加入200 μL PBS緩沖液,室溫清洗酶標板3次,每次10分鐘;每孔加入200 μL封閉液(3% BSA)封閉酶標板,室溫封閉1小時;


      8.4 棄封閉液,每孔加入200 μL PBST(1×PBS加0.1% Tween20,下同)緩沖液,室溫清洗酶標板3次,每次10分鐘;


      8.5 每孔加入120 μL 3% BSA后再加入80 μL步驟8.2離心后得到的噬菌體上清液,室溫孵育2小時;棄掉酶標板內液體,每孔加入200 μL PBST緩沖液洗滌3次,每次10分鐘;


      8.6 每孔加入M13 Bacteriophage Antibody(HRP),Mouse Mab,0.1 ng/μL稀釋于封閉液中,100 μL /孔,室溫孵育1小時;


      8.7 棄掉ELISA板內液體,每孔加入200 μl PBST緩沖液洗滌3次,每次10分鐘;


      8.8 每孔加入100 μL TMB單組份顯色液,避光顯色2-3 分鐘,每孔加入100 μL 1M Hcl終止,用酶標儀讀取OD450值,記錄并保存;

      選取抗原包被孔與相應對照孔吸光值比例大的菌落送去測序(獨立兩次phage-Elisa分析),得到候選納米抗體的基因序列。



      07
      抗原篩選技巧


      1.適量的抗原包被和抗原的分子量大小、疏水親水性質、結構有關,也和包被緩沖液和包被介質的選擇有關,合理的包被是成功篩選的基礎,如果有必要可以進行預實驗確定包被的條件或者可選擇抗原結合磁珠的方法進行篩選。


      2.洗脫后測定噬菌體的效價,經過2-4輪抗原包被淘選后,噬菌體的富集程度需要在合理范圍之內。


      噬菌體洗脫液效價檢測

      10`                 免疫效果檢測圖             



      08
      納米抗體表達純化推薦流程


      Phage-Elisa篩選出的單克隆菌株進行納米抗體片段DNA測序后即可進行表達純化及驗證。


      納米抗體可在大腸桿菌,酵母或哺乳動物細胞系里進行表達,因其僅含100多個氨基酸殘基,為驗證其是否與抗原結合,可構建質粒在大腸桿菌中或酵母菌株中進行快速表達及純化,或者同時在兩種菌株中進行表達純化。



      09

      大廠桿菌中納米抗體

      的誘導表達及純化


      質粒構建序列確認后轉化表達菌株,如BL21,挑取單菌落進行搖瓶培養后IPTG誘導表達,菌體破碎后將上清液中可溶蛋白進行純化,包括親和層析,離子交換層析及分子篩層析等方法。



      10

      畢赤酵母中納米抗體

      的表達及純化


      質粒構建序列確認后及酶切線性化后將線性化質粒電轉進酵母如GS115X33菌株中,平板上篩選確認單菌落后甲醇誘導表達,分泌至胞外,發酵液上清中的納米抗體可直接Elisa驗證,陽性序列進行純化。


      大腸桿菌表達的優點是可迅速誘導表達,缺點部分納米抗體可形成包涵體,其胞內還原環境不利于納米抗體中二硫鍵的形成,畢赤酵母表達的優點是可利用畢赤酵母對蛋白進行胞外分泌,從而不用進行菌體破碎,而直接從酵母發酵上清液中進行納米抗體純化,并且酵母很少分泌雜蛋白至胞外使得發酵上清液中的納米抗體純度相對較高從而易于純化,并且胞外的氧化環境有利于納米抗體二硫鍵的形成,納米抗體中二硫鍵的形成對納米抗體的穩定性至關重要。




      11

      候選納米抗體純化后可驗證

      其余抗原是否結合及與抗原

      結合的親和力檢測


      SPR實驗利用的機型為BiacoreT200,具體操作流程詳見《BiacoreT200檢測蛋白與蛋白結合操作指南》。



      12

      納米抗體的規模表達純化


      因納米抗體為分子量約15KD左右的單鏈蛋白,其可由大腸桿菌或酵母中進行誘導表達并在發酵罐中規模表達,其產量均在g/L以上,故可進行量產應用于試劑盒檢測,甚至臨床藥物規?;慨a。


      11



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